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線蟲ttTi5605基因座表達載體
概述
對模式生物秀麗隱桿線蟲（C. elegans）而言，在其基因組特定位點引入單拷貝外源基因是一種常見的研究模式。ttTi5605基因座表達載體是一種經過良好驗證的可用于線蟲的特定位點的外源基因單拷貝插入的高效系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用Mos1轉座子剪切機制或CRISPR機制向線蟲引入穩(wěn)定整合的外源基因插入。
Mos1轉座子首先在果蠅（Drosophila mauritiana）中被發(fā)現。當前，相當一部分的線蟲種屬已經被開發(fā)出包含確定的Mos1轉座子插入位點。一個例子是基因組ttTi5605區(qū)域包含了Mos1位點的線蟲種屬。使用ttTi5605基因座的原因在于在該區(qū)域插入序列不會擾亂臨近基因的功能。此外，Mos1轉座子剪切技術可以將外源基因以單拷貝的方式插入基因組，不容易被線蟲自身的RNAi系統(tǒng)沉默（重復元件序列通常易被細胞轉錄抑制）。Mos1介導的ttTi5605位點的基因特異性重組需要ttTi5605基因座表達載體與一個表達轉座酶的輔助質粒共轉染線蟲。通過熱激法可以激活轉座酶活性，從而導致Mos1轉座子在線蟲基因組發(fā)生剪切。斷開的DNA雙鏈可以被外部提供的序列修復并產生穩(wěn)定的基因重組。通過Mos1介導的單拷貝插入（Mos1-mediated Single Copy Insertion，MosSCI）技術，目的基因可以被整合至線蟲的ttTi5605位點。
ttTi5605基因座表達載體包含一系列重要元件幫助高效表達目的基因。首先，該載體可以使用多種類型的啟動子如線蟲廣泛性啟動子、線蟲組織特異性啟動子以及熱激活蛋白啟動子驅動目的基因表達。線蟲特異性啟動子spec-1、myo-2和 myo-3已被證明可以在線蟲中實現目的基因的組織特異性表達。其次，該載體也包含一個帶有polyA加尾信號序列的3’ UTR，可以轉錄后調控蛋白表達。最后，載體還引入了一個野生型C. Briggsae線蟲的unc-119基因作為陽性篩選標記。Unc-119(ed3)突變的線蟲體型小、呈現出運動不協調表型，并且在缺乏食物時不能進入dauer狀態(tài)。轉染ttTi5605基因座表達載體后，只有恢復野生型表型的線蟲表明轉染是成功的。
使用Mos1轉座子產生的DNA雙鏈重組是稀少事件，而更大范圍的基因組修飾可以使用CRISPR技術。ttTi5605基因座表達載體也能應用于Cas9觸發(fā)的DNA同源重組。針對這種應用，一個打靶ttTi5605位點臨近序列的sgRNA載體與一個Cas9蛋白需要被轉染至線蟲體內。
關于該載體系統(tǒng)的更新信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Nature. 413:70 (2001); Nat Genet. 40: 1375 (2008) | Strong and heat-shock inducible promoter in somatic cells and germline |
| Nat Genet. 40:1375 (2008) | Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans |
| Nat Genet. 40:1375 (2008); Worm. 4:e1046031 (2015) | Unc-119 mutant rescue selection |
| Curr Biol. 1476:82 (2008) | Post-transcriptional regulation of 3' UTR containing polyA signal |
亮點
ttTi5605基因座表達載體可以將外源基因高效插入線蟲基因組。連同表達轉座酶的sgRNA/Cas9載體，ttTi5605 Mos1靶向質?？梢詫崿F位點特異的單拷貝外源基因插入。
優(yōu)勢
載體DNA永久整合：向線蟲轉染普通質粒只能實現瞬時轉染，外源基因將隨時間在宿主細胞內逐漸丟失。而ttTi5605基因座表達載體可以整合轉基因至細胞基因組并穩(wěn)定表達，可用于基因序列的精確編輯以及構建轉基因線蟲。
技術簡單：向線蟲轉染質粒載體是技術上相對直接且對比病毒載體需要包裝生產而更為簡單的方式。可以使用電轉染、顯微注射或者喂食包含質粒載體的大腸桿菌等方式將質粒導入線蟲體內。
不足之處
MosCI系統(tǒng)不能同時編輯多個基因。此外，使用該系統(tǒng)獲得轉基因動物模型通常需要超過15天。
載體關鍵元件
ttTi5605-LA: Left homology arm (1,336 bp) targeting C. elegans ttTi5605 locus.
Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.
Kozak: Kozak consensus sequence. This is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.
ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.
3' UTR+polyA: Allows transcription termination and polyadenylation of mRNA transcribed by RNA polymerase II. It functions in somatic and germ cells.
Unc-119(+): Facilitates the use of the unc-119 mutant rescue as a selection marker for transgene insertions when using C. elegans unc-119 mutants as the background.
ttTi5605-RA: Right homology arm (1,428 bp) targeting C. elegans ttTi5605 locus.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
